Experimente

Experimente BLJ Ausgabe 1: Enzymatik

MINT-ase: Amylase unter Beobachtung

Das (Nano)Photometer in Aktion

Experimente 1, 2 und 3:

Aufgabenstellung:
Den Geschwindigkeitsverlauf des Stärkeabbaus durch das Enyzm Amylase mithilfe der Iod-Stärke-Reaktion und eines Photometers visualisieren und halbquantitativ analysieren.

Verwendete Geräte:
→ (Nano)Photometer mit Datenausgabe
2 Glasküvetten (10 mm)
2 Mikropipetten (1000 μl und 100 μl, verstellbar)
Pasteurpipetten aus Glas zum Durchmischen
Glaswaren zum Anfärben und für den Demonstrationsversuch

Verwendete Chemikalien:
Stärke gelöst (→ Hydroxyethylstärke HES 130.000 Dalton/ Substitutionsgrad 0.4)
Lugolsche Lösung (1 %ige wässrige Iod-Kaliumiodidlösung nach Lugol)
Amylase gelöst (→ Amylase-Präparat GA 500)
Aqua Dest. (nur für Experiment 3, induktiver Ansatz, s. unten)

Durchführung:
15 ml Stärke-Lösung in Glaswaren mit 400 μl Lugolscher Lösung versetzen
(mind. 4 h vor dem Versuch ansetzen, um Drift des Signals zu minimieren).
3 ml der angefärbten Stärke-Lösung in die Glasküvette pipettieren.
Messung im (Nano)Photometer auf 585 nm / 25 min (Blank: Abreagierte Lösung).

Experiment 1: Zugabe von 200 μl Amylase-Lösung nach ca. 5 min.
Experiment 2: Zugabe von 100 μl Amylase-Lösung nach ca. 5 min,
erneute Zugabe von 100 μl Amylase-Lösung
(z.B. bei Abnahme des Absorptionswertes um 30%)
Experiment 3: Der erste Teil wird wie in Experiment 1 durchgeführt.
Zudem wird in einem zweiten Experiment eine 1:1 mit Aqua Dest. verdünnte HES-Lösung gemessen, die mit derselben Menge Lugolsche Lösung wie in Experiment 1 versetzt wurde. Dieser Ansatz mit nun halbierter Stärkekonzentration wird dann nach 5 min mit 50% der im ersten Teil eingesetzten Enzym-Lösung versetzt.
Die (Gesamt)-Iodkonzentration in der Küvette soll der Iodkonzentration im Experiment 1 entsprechen, da der Anteil des lichtabsorbierenden  Polyiodidstärke-Komplexes  auch von der Iodkonzentration abhängig ist.

Anmerkungen zur Durchführung:
Der Stärkeabbau wird durch eine photometrische Messung des gefärbten Stärke-Iod-Komplexes verfolgt. Um unerwünschte Drift des Signals zu reduzieren, hat sich das Anfärben der Stärkelösung einige Stunden vor dem Versuch bewährt. Weiterhin sollte auf die Verwendung von Kunststoffküvetten verzichtet werden, da sich Iodteilchen im Kunststoff lösen können und es so zu einer störenden Anfangsdrift im Signal kommt (Stabilisierung ca. 30 min nach Zugabe in die Kunststoffküvette, jedoch schlecht zu kontrollierender Anfangsabsorptionswert).

Beobachtungen:

Experiment 1 (Details)

Experiment 1 (Auswertung)

Experiment 2

Experiment 3 (wird in Kürze hochgeladen, bitte schauen Sie noch einmal vorbei)

 

 

Auswertung:
Die Projektion der Echtzeit-Messung z.B. über den Beamer auf ein Whiteboard erleichtert das direkte Einzeichnen von Steigungsdreiecken und ist daher sehr praktisch für eine schnelle Analyse, aber es kann auch auf einer Kreidetafel gearbeitet werden.

Es empfiehlt sich die halbquantitative Analyse der Reaktionsgeschwindigkeit über die Gleichsetzung des Anfangsabsorptionswertes mit 100%  Stärkekonzentration:
(A0 = 100 % × c (Stärke))

Ein quantitativer Ansatz empfiehlt sich nicht, da die Enzymgeschwindigkeit auch von der Molekülgrösse der Hydroxyethlystärke abhängt (in unserem Ansatz ca. 130.000 Dalton), diese aber als Variable nicht kontrollierbar ist da sie sich während des Versuches ändert).

Diskussion:
Experiment 1 und 2 visualisieren die sich in Abhängigkeit von der Substratkonzentration (Exp. 1) sowie Enzymkonzentration (Exp. 2) ändernde Reaktionsgeschwindigkeit. Die Diskussion mit Verweis auf das Konzept des Substrat-Enzym-Komplexes erfolgt nun anhand „erfahrener“ Daten, also mit konkretem Bezug. Dennoch liegt die Erklärung klar auf der Abstraktionsebene der Teilchen.

(Die Diskussion des induktiven Ansatzes im Experiment 3 wird in Kürze freigeschaltet, bitte schauen Sie dafür noch einmal vorbei.)

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